触目惊心,中美科学家5年前曾制造出类SARS新冠病毒

触目惊心,中美科学家5年前曾制造出类SARS新冠病毒-火星博客

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触目惊心,中美科学家5年前曾制造出类SARS新冠病毒-火星博客

 

实际上,五年前中美病毒科学家通过实际提取、鉴定后又培养制造出了类SARS新冠病毒这一过程,已预知新冠病毒极强传播性的社会风险,而当时所有预知的内容也都与本次发生的疫情状况高度相似。


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林志佳 等 | 钛媒体编辑部


由中国武汉开始爆发的新型冠状病毒肺炎疫情持续引发关注,从 1 月 21 日开始证实新冠病毒肯定有“人传人”之后,一场全民参与的抗疫战役在中国,乃至世界正式打响。


目前已知 2019 年 12 月开始,从第一起华南海鲜市场病例被证实,与SARS冠状病毒极为类似的一种“不明病毒肺炎”新型冠状病毒开始蔓延。


但是钛媒体(微信ID:taimeiti)最近在仔细研究和整理新冠病毒相关研究时也发现,其实早在 5 年前,也就是 2015 年,美国病毒学家牵头联合中国病毒专家就曾合作成功提取和鉴定出了一种类SARS新型冠状嵌合病毒,并且之后又成功在实验中制造和培养出了一种SARS新型冠状重组病毒。这次的研究成果也被发表在了2015年的国际顶级科学杂志《Nature》上(下称:Nature论文)。


在此刻新冠病毒肺炎爆发之时,回过头来再看这份五年前的研究报告,依然颇觉触目惊心。虽然并不能证明五年前的研究发现和本次发生的武汉肺炎病毒是完全同一的病毒,但是的确都是与SARS极为相近的新冠病毒,在今年1月,有专家认为本次“不明肺炎”疫情,传播速度快、重病率高、难以”防控”的态势,是世界首次发生的时候,实际上,五年前就早有发生,而病毒科学家也早有预知,并且所有预知的内容都与本次发生的疫情状况高度相似。


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人体内新冠病毒(Coronavirus)渲染图(来源:科学图片库)


这份研究报告由美国学者和中国学者联合完成,作者包括美国德克萨斯大学医学分校微生物与免疫学系 教授Vineet D. Menachery ,中科院武汉病毒研究所研究员石正丽(Zhengli-Li Shi)等人,他们提取发现并又制造培养了一种嵌合型 SARS样 的新型冠状病毒,根据论文所述,该病毒能让小鼠感染上 SARS(非典肺炎),也可以证实这一病毒通过蛋白外壳与体内 RNA 进行结合,感染和传递到人类细胞当中,报告结论就是这种类SARS新冠状病毒,因其高度可人际传播的属性,可能会给人类带来巨大的社会风险。


五年前的预言一语成谶,同时这份研究报告也说明,本次武汉疫情可能不是偶然的,类SARS冠状病毒的变异和传播从未停止,但人类并未重视。正如近日,北卡罗来纳州吉林斯大学全球公共卫生学院的冠状病毒专家兼助理教授蒂莫西·谢汉(Timothy Sheahan)评价武汉新冠肺炎所说,“这不是“一次性”的病毒疫情,很可能会在未来持续发生。”


针对近期沸沸扬扬的关于武汉病毒研究所的猜测和争议,石正丽在其朋友圈发表声明称:“以生命担保,2019新冠病毒与实验室无关,这是大自然对人类不文明生活习惯的惩罚”。


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武汉病毒研究所研究员石正丽


2015年到底发生了什么?

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2015年的Nature论文中阐述了一个背景,即当时在中国有一个叫做马蹄蝠的蝙蝠种群,这是一种在岩洞栖息地里的菊头蝠科蝙蝠群体,它们体内正在流行一种类似SARS的病毒——SHC014-CoV,而当时严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS)-CoV的出现,突出了跨物种传播事件对人类社会的威胁,故而科学家们希望研究在马蹄蝠中流行的这一病毒的致病潜力。


蝙蝠是许多病毒的自然宿主,包括埃博拉病毒、马尔堡病毒,狂犬病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒等。由于蝙蝠特殊的免疫系统,携带病毒却极少出现病症。在漫长的进化历程中,蝙蝠成为了上百种病毒的自然宿主。对于病毒溯源的研究来说,蝙蝠地位很特殊,是重点的关注对象。


中国科研人员已发现,蝙蝠体内一个被称为“干扰素基因刺激蛋白-干扰素”的抗病毒免疫通道受到抑制,这使得蝙蝠刚好能够抵御疾病,却不引发强烈的免疫反应。野生蝙蝠可能会携带很多病毒,但是它们都维持在一个较低的水平上。


于是,Vineet D. Menachery教授等利用SARS-CoV的反向遗传系统,从中提取并鉴定了一种嵌合病毒,该病毒在适应小白鼠的SARS-CoV主干中可表达出蝙蝠冠状病毒SHC014的刺突。结果表明,该新型冠状病毒能利用SARS的人类细胞受体——血管紧张素转换酶II(ACE2)的多个同源基因,在人类呼吸道原代细胞中有效复制,并在体外获得与SARS传染性同等的效果。


此外,体内实验证明,该嵌合病毒被复制在小白鼠肺部后,可导致明显的发病征状。评估显示,现有的基于SARS的免疫治疗和预防模式的效果不佳;单克隆抗体和疫苗方法均未能利用这种新的刺突蛋白来中和免疫CoVs感染。


基于以上这些发现,上述科学家们最终成功合成了一株具有感染性的全长SHC014重组病毒,并同时在体外和体内证实了该病毒的强大复制能力。研究结果表明,这种病毒完全可重现SARS-CoV(SARS冠状病毒)的传播风险。


Nature论文三种范例证明的新冠病毒传播原理,与武汉疫情高度类似

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以下都来自钛媒体编辑翻译并整理了上述2015年《Nature》论文中的主要分析内容,传播原理的确与本次武汉新冠肺炎类似,很多结果也类似,例如关于致病性不会比SARS冠状病毒增强、人传人潜在风险极大(传染性大)、老年动物(实验主要以动物进行实验)更易感等。


高致病性冠状病毒SARS冠状病毒的出现,预示着严重呼吸疾病跨物种传播的新时代。全球化为病毒的快速传播带来基础,对全球经济有着巨大影响。


在SARS席卷全球后,甲型流感亚型病毒H5N1、H1N1和H7N9以及MERS冠状病毒(中东呼吸综合征)开始出现,并且可以同样通过动物传染人类,对当地人口带来了死亡的阴影以及经济损失。


尽管公共卫生措施控制了SARS冠状病毒的爆发,但最近的宏基因组研究通过识别近期在中国马蹄蝠中大面积流行的类SARS冠状病毒的病毒序列,发现这些由蝙蝠携带的病毒有可能在未来带来更多的威胁。


但是,病毒序列带来的数据只能为将来识别以及预防类似流行性病毒提供非常有限的洞见。因此,为了分析蝙蝠携带的冠状病毒引起流行性传播的可能性(也即是传染人类的可能性),我们提取了中国马蹄蝠携带的RsSHC014冠状病毒序列中可造成人畜传染的冠状病毒刺穿蛋白,使用适应小白鼠的SARS冠状病毒主链培育出了一种嵌合病毒。


培育出来的混合病毒让我们能够评估该刺穿蛋白在没有经过自然适应性变异的情况下感染人类的能力。通过这个方法,我们对人类气道细胞在活体状态下由SHC014冠状病毒导致的感染特征进行了分析,测试了现有的免疫和治疗方法对SHC014冠状病毒的作用。这个研究方法能对宏基因组学数据进行解读,帮助预防未来可能会出现的病毒,并未将来疫情爆发的可能性做好准备。


SHC014和相关的RsWIV1冠状病毒的序列显示,该类冠状病毒为SARS冠状病毒(图示1a,b)的近亲。但是,SHC014和SARS冠状病毒在结合人类的14残基和SARS冠状病毒受体中存在差异。受体包括5个决定宿主范围的残基:Y442、L472、N479、T487和Y491 。在WIV1中,其中三个残基与Urbani SARS冠状病毒不同,按原本预期,它们不会改变和ACE2的结合。


这一情况由两个假型化实验得到证实。其中一个实验测试了慢病毒属WIV1刺穿蛋白进入细胞释放血管紧张素转换酶II(AC2)的能力。另一实验为复制WIV1冠状病毒(ref. 1)的试管实验。在SHC014中存在14个与ACE2有相互作用的残基,其中有7个残基和SARS冠状病毒的不一样,这包括了所有5个对决定宿主范围起关键作用的残基。


这些变化,以及释放SHC014刺穿蛋白进入细胞的慢病毒假型实验,表明SHC014刺穿蛋白无法与人类的ACE2进行结合。


但是,有研究发现,其他相关的SARS冠状病毒株存在类似变化,这意味着我们需要做进一步的功能测试才能做出更好的判断。因此,我们基于复制功能强、实应小白鼠的SARS冠状病毒主链合成了SHC014刺穿蛋白(该嵌合冠状病毒在后文统称为SHC014-MA15),以研究小白鼠的发病机理和疫苗研究。与现有分子建模和假型实验得出的预测不同,SHC014-MA15保持了活性,并且在Vero细胞中复制致高滴度。


类似于SARS病毒,SHC014-MA15同样需要功能正常的ACE2分子才能进入细胞,并且可以使用与人类、果子狸和蝙蝠直系同源ACE2。为了测试SHC014刺穿蛋白感染人类气道的能力,我们研究了人类上皮气道细胞系Calu-3 2B4对感染的敏感性,发现SHC014-MA15具有强大复制能力,与Urbani SARS病毒相当。


除此之外,人类主要气道上皮(HAR)培养物被感染,两种病毒都展现出了强大的复制能力。总之,这些数据证实了带有SHC014的病毒感染人类气道细胞的能力,并显示出了SHC014冠状病毒具备跨物种传播的潜在威胁。



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图|SARS 样的冠状病毒在人类气道细胞中复制并产生体内的发病机理


为了评估SHC014次突蛋白在体内介导感染中的作用,我们用104个SARS-MA15或SHC014-MA15空斑形成单位 (p.f.u.)感染了10周大小的BALB/c小白鼠(图1e-h)。


感染SARS-MA15的白鼠在感染后第4天出现体重迅速下降和死亡现象(d.p.i.);而感染了SHC014-MA15的小白鼠体重下降显著(10%),但无死亡(图1e)。


对病毒复制的检测显示,感染了SARS-MA15或SHC014-MA15的小鼠肺部病毒滴度几乎相同(图1f)。感染了SARS-MA15的小白鼠的肺的末梢细支气管和肺实质(图1g)均有较强程度的染色(图1g),而被SHC014-MA15感染的小白鼠的肺抗原染色较弱(图1h);与此相反,在软组织或整体组织评分中未发现抗原染色缺陷,这表示肺部组织对SHC014-MA15的感染情况有异(补充表2)。


感染SARS-MA15的动物体重迅速下降,并死于感染(补充图3a,b)。感染SHC014-MA15可导致动物体重显著下降,但致死率极低。在年轻小白鼠中观测到的组织学和抗原染色模式,在年长些的白鼠中也可观测到(补充表3)。我们使用Ace2−−老鼠进行实验,排除了SHC014-MA15通过另一种感染受体传播的可能性。


该种情况下,小白鼠没有体重下降,或被SHC014-MA15感染后的抗原染色现象(补充图4 a, b和补充表2)。以上这些数据表明,具有SHC014刺突的病毒能够在CoV病毒主干的条件下致使小白鼠体重减轻。


考虑到埃博拉单克隆抗体疗法(例如 ZMApp 10)的临床功效,我们接下来试图确定 SARS-CoV 单克隆抗体对抗 SHC014-MA15 感染的功效。广泛中和针对 SARS 冠状病毒刺突蛋白已经被先前报道,并且是免疫试剂可能人类单克隆抗体。


我们检查了这些抗体对病毒复制的影响(表示为病毒复制的抑制百分比),发现野生型 SARS-CoV Urbani 在相对较低的抗体浓度下被所有四种抗体强烈中和,SHC014-MA15的中和效果有所不同。通过噬菌体展示产生的和逃避突变型的抗体,仅实现抑制 SHC014-MA15 复制(如图 2a)。同样,源自 SARS-CoV 感染患者的记忆 B 细胞的抗体 230.15 和 227.14 也未能阻止SHC014-MA15复制(图 2b,c)。


对于所有三种抗体, SARS 和 SHC014 尖峰氨基酸序列之间的差异对应于 SARS-CoV 逃逸突变体(fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E)中发现的直接或相邻残基变化,这可能解释了抗体的缺失针对SHC014的中和活性。


最后,单克隆抗体 109.8 能够实现 SHC014-MA15 的 50% 中和,但仅在高浓度(10μg/ ml)时(图2d)。总之,结果表明,针对 SARS-CoV 的广泛中和抗体可能仅对新兴 SARS 样 CoV 菌株(如 SHC014)具有边际功效。


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图|SARS-CoV单克隆抗体对SARS样CoV的疗效折线图


为了评估现有疫苗抵抗 SHC014-MA15 感染的功效,研究人员用双重灭活的完整 SARS-CoV(DIV)疫苗接种了老年小鼠。先前的工作表明,这种疫苗接种方式可以中和并保护年轻小鼠免受同源病毒的攻击;然而,该疫苗未能保护其中还观察到增强的免疫病理的老年动物,这表明由于疫苗接种,动物受到了伤害。在这里,我们发现 DIV 不能在体重减轻或病毒滴度方面提供 SHC014-MA15 的抗攻击保护(图5a,b)。与其他异源组 CoV 的先前报告一致。此外,来自接种 DIV 的老年小鼠的血清也未能中和 SHC014-MA15(如图5c)。


值得注意的是, DIV 疫苗接种导致了强大的免疫病理和嗜酸性粒细胞增多。这些结果证实,DIV 疫苗不能预防 SHC014 感染,并且可能增加老年接种组的疾病。


与用 DIV 疫苗接种相比,将 SHC014-MA15 用作减毒活疫苗显示了针对 SARS-CoV 攻击的潜在交叉保护作用。论文当中的研究人员表示,其用 10 4pfu 的 SHC014-MA15 感染幼鼠,并观察了 28 天。然后,在第 29 天,他们用 SARS-MA15 攻击了小鼠。


尽管在 SHC014-MA15 感染后28 天内产生的抗血清,只有极少的 SARS-CoV 中和反应,但先前用高剂量 SHC014-MA15 感染的小鼠可防御致命剂量的 SARS-MA15 攻击。


在没有二级抗原升压的情况下,28 dpi 表示的抗体滴度的预期峰值,意味着有将随时间而减少针对 SARS-CoV 的保护。在体重减轻和病毒复制方面,在衰老的 BALb/c 小鼠中观察到了类似的结果,表明用致死剂量的SARS-CoV攻击具有保护作用。然而,在某些老年动物中,SHC014-MA1 5感染剂量为 10 4pfu,导致体重减轻和致死率> 10%。


研究人员发现,以较低剂量的 SHC014-MA15(100 pfu)进行疫苗接种不会诱导体重减轻,但也无法保护老年动物免受 SARS-MA15 致命剂量的攻击。总之言之,根据论文的说法,数据表明,SHC014-MA15 攻击可能通过保守的表位赋予针对 SARS-CoV 的交叉保护作用,但所需剂量可诱发发病机理,并不能用作减毒疫苗。


确定 SHC014 尖峰具有介导人类细胞感染并引起小鼠疾病的能力后,我们接下来基于用于SARS-CoV的方法合成了全长SHC014-CoV感染性克隆。在Vero细胞中复制显示SHC014-CoV相对于SARS-CoV没有缺陷;然而,在感染后24小时和48小时,原代HAE培养物中SHC014-CoV显着减弱(P <0.01)。


与SARS-CoV Urbani相比,小鼠的体内感染没有显示出明显的体重减轻,但在全长SHC014-CoV感染的肺部显示出病毒复制减少。总之,这些结果确定了全长SHC014-CoV的生存力,但表明其复制必须与人类呼吸道细胞和小鼠中流行的SARS-CoV的复制相一致,需要进一步的适应。


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图|SHC014-CoV在人呼吸道中复制,但缺乏流行性SARS-CoV的毒力


在 SARS 冠状病毒流行期间,人们很快发现了棕榈科动物和人类冠状病毒之间的联系。基于这一发现,有两种不同观点范例表述。其中,第一种观点认为,流行性 SARS-CoV 起源于蝙蝠病毒,跃迁至小窝并在受体结合域(RBD)内引入了变化,以改善与麝猫 Ace2 的结合,随后在活畜市场上接触人,使人感染了麝香毒株,而该麝香毒株又适合成为流行毒株。


但是,根据发育周期以及数据分析表明,早期人类SARS菌株与蝙蝠菌株的关系似乎比灵猫菌株更为紧密。因此,第二种观点认为蝙蝠直接传播导致SARS-CoV的出现,而棕榈科动物则是继发宿主和持续感染的宿主。对于这两种范例,都认为必须在二级宿主中适应峰值,因为大多数突变预计会在RBD内发生,从而有助于改善感染。两种理论都暗示蝙蝠冠状病毒的库是有限的,宿主范围的突变既是随机的又是罕见的,从而降低了人类未来出现突发事件的可能性。


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图|冠状病毒的出现(传播)范例

 

尽管Nature论文表示,这一新的研究,并未打破上述说法与范例,但也的确提出了第三种范式,这一论文的作者团队认为,蝙蝠 CoV 病毒细胞为了保持“平衡”的刺突蛋白,能够在不突变的情况下感染人类。通过在SARS-CoV主链中包含SHC014刺突的嵌合病毒在人气道培养物中和在没有RBD适应的小鼠中引起强烈感染的能力可以说明这一假设。


加上以前鉴定的致病冠状病毒主链的观察,上述论文研究结果表明,SARS 样菌株所急需的原材料目前正在动物水库中流通。值得注意的是,尽管全长SHC014-CoV可能需要额外的骨架适应性来介导人类疾病,但有记录的CoV家族中的高频重组事件强调了未来出现的可能性和进一步准备的必要性。


迄今为止,动物种群的基因组学筛选已主要用于鉴定暴发环境中的新型病毒。这里的方法将这些数据集扩展为检查病毒出现和治疗功效的问题。我们认为,具有SHC014尖峰的病毒由于其在原代人类气道培养物中复制的能力而成为潜在的威胁,这是人类疾病的最佳可用模型。另外,在小鼠中观察到的发病机制表明含有SHC014的病毒能够在没有RBD适应的情况下在哺乳动物模型中引起疾病。


值得注意的是,相对于SARS-CoV Urbani,与SARS-MA15相比,肺中的向异性和HAE培养物中全长SHC014-CoV的衰减相对于SARS-CoV Urbani而言,提示了ACE2结合以外的因素-包括穗突性,受体生物利用度或拮抗宿主免疫反应中的一部分可能有助于出现。然而,需要对非人类灵长类动物进行进一步测试,以将这些发现转化为人类致病潜能。重要的是,现有治疗方法的失败定义了进一步研究和开发治疗方法的关键需求。有了这些知识,就可以产生监视程序,诊断试剂和有效的治疗方法,从而防止出现组别特异性CoV,例如SHC014,并且可以将其应用于维护相似异质库的其他CoV分支。


在以前出现的模型的基础上,研究人员认为,新型冠状病毒并没有增强致病性。作者表示,预计不会产生嵌合病毒(例如SHC014-MA15)会增加致病性的情况。虽然SHC014-MA15相对于其亲本小鼠适应的SARS-CoV减毒,但类似的研究检查了MA15骨架内野生型Urbani尖峰的CoV的致病性,显示小鼠无体重减轻,病毒复制减少。因此,相对于Urbani峰值–MA15 CoV,SHC014-MA15的发病机理有所改善。


基于这些发现,科学评论小组可能认为类似的研究基于无法冒险进行的循环株构建嵌合病毒,因为不能排除哺乳动物模型中致病性的增加。再加上对小鼠适应株的限制以及使用逃逸突变体开发单克隆抗体的研究,对CoV出现和治疗功效的研究可能会严重受限。这些数据和限制加在一起,代表了新冠病毒研究关注的十字路口。在制定前进的政策时,必须权衡准备和缓解未来爆发的潜力与创造更多危险病原体的风险。


总体而言,研究人员利用实验和分析,对已使用宏基因组学数据来识别由循环蝙蝠SARS状CoV SHC014构成的潜在威胁。由于嵌合的SHC014病毒在人气道培养物中复制的能力,在体内引起发病机理并逃避当前的治疗方法,因此需要针对循环的SARS样病毒的监视和改进的治疗方法。我们的方法还可以利用宏基因组学数据来预测病毒的出现,并将这些知识应用于准备治疗未来出现的病毒感染。


培养并制造出新冠病毒的实验过程

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以下是钛媒体编辑整理了上述论文中科学家们培养并制造出一种新型冠状病毒的实验过程,这一过程被称为“病毒,细胞,体外感染和噬菌斑测定方案”。


科学家将从美国陆军传染病研究所获得的野生型 SARS-CoV(Urbani),适应小鼠的 SARS-CoV(MA15)和嵌合型 SARS 型 CoV 病毒细胞在 Vero E6 培养基细胞上。据悉,这一细胞是根据美国病毒学家杜尔贝科(Dulbecco,Renato) 所研制出改良的 Eagle’s 培养基上生长。


另外,获得到的病毒细胞组织,是通过之前研究的信息进行的,其中包括表达 ACE2 直向同源物的 DBT 细胞(Baric实验室,来源未知),这些都在先前被描述为人类和麝猫感染的细胞组织,ACE2 序列是基于从菊头蝠,就是蝙蝠 DBT 细胞当中提取,并从中建立新的病毒培养。


作者表示,这一实验本身是伪型实验过程,与使用基于 HIV 的伪病毒实验类似,先前使用武汉病毒研究所提供的 ACE2 直系表达的同源物种的 HeLa 细胞进行检查,HeLa 细胞在最低必需培养基补充有 10% FCS(Gibco公司,CA)以及 MEM(Gibco公司,CA)中生长,得出下图在Vero E6,DBT,将Calu-3和2B4原代人呼吸道上皮细胞的生长曲线。


实验物,也就是仿制的肺,则是在北卡罗来纳大学机构审查委员会批准下采购的,而这种肺并不是活体的肺,是在 HAE 培养的人肺。该 HAE 培养物代表高度分化的人气道上皮,其中包含纤毛和非纤毛上皮细胞以及杯状细胞,培养物应在气液界面上生长数周,才拿到该实验当中。


而后,将细胞用 PBS 溶液进行洗涤,并用病毒接种或在 37℃ 的 PBS 溶液中模拟稀释 40 分钟。将细胞洗涤 3 次,并加入新鲜培养基以表示时间 “0”。在每个所述的时间点收获三个或更多的生物重复样品,所有病毒的培养均在生物安全级别(BSL)为 3 级的实验室中进行。


人员和环境方面,将冗余的生物细胞放进对应的安全柜中,并有电扇进行散热。所有人员都穿着特别的卫生强化防护服,为了实验过程的健康,相关科研人员使用 3M 电动呼吸器(Breathe Easy,3M)进行呼吸,并严格佩戴双手套,使得实验在安全状况下进行。


序列聚类和结构建模


实验中,从 Genbank 或 Pathosystems 资源整合中心(PATRIC)下载具有代表性的 CoV S1 结构域的全长基因组序列和氨基酸序列,并与 ClustalX 进行比对,通过系统分析使用 100 个自举法或使用 PhyML(https://code.google.com/p/phyml/)封装。


事实上,这一过程主要是将数据进行比对,对病毒的未来变异进行管控,形成一定的数据模型。


接着,科研人员使用 PhyML 软件包生成最大可能性数值树。比例尺代表核苷酸取代。仅标记引导程序支持高于 70% 的节点。该树显示 CoV 分为三个不同的系统发育组,分别定义为 α-CoV,β-CoV 和 γ-CoV。对 于β-CoV,经典子群群集标记为 2a,2b,2c 和 2d,对于 α-CoV,标记为 1a 和 1b。使用 Modeller(Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit)生成结构模型,以基于晶体结构 2AJF(蛋白质数据库)生成 SARS RBD 的 SHC014 和 Rs3367 与 ACE2 的同源性模型。在 MacPyMol(1.3版)中可视化和操作同源模型。


SARS样嵌合病毒的构建


如前所述,野生型和嵌合病毒均来自 SARS-CoV Urbani 或相应的小鼠适应性(SARS-CoV MA15)感染性克隆(ic)病毒细胞。通过提取含有 SHC014 刺突序列的质粒,并连接到 MA15 感染性克隆的 E 和 F 质粒中。设计该克隆并从 Bio Basic 购买六种连续 cDNA,并使用侧接独特的 II 类限制性核酸内切酶位点(BglI)的公开序列。


之后,研究人员对其扩增,切除,连接和纯化含有野生型,嵌合 SARS-CoV 和 SHC014-CoV 基因组片段的质粒。然后进行体外转录反应以合成全长基因组 RNA,如先前所述将其转染到 Vero E6 细胞中。收获转染细胞的培养基,并用作后续实验的种子库。在用于这些研究之前,通过序列分析证实了嵌合和全长病毒。嵌合突变体和全长 SHC014-CoV 的合成构建,这一新的 SARS样嵌合病毒标准,需要得到北卡罗莱纳大学机构生物安全委员会和关注双重用途研究委员会的批准。


小鼠体内感染


事实上,这份实验需要根据人体,来了解抵抗力以及病毒形成活动,多数据下,形成小鼠体内感染的数据分析。


论文中称,其从 Harlan Laboratories 订购了雌性、10 周龄和 12 个月大的 BALb/c 白变种实验室老鼠。将动物带入 BSL3 实验室,并使其在感染前适应 1 周。对于感染和减毒活疫苗接种,将用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物对小鼠进行麻醉,并在鼻腔感染时用 50μl 磷酸盐缓冲液(PBS)或稀释的病毒经鼻内感染,每个时间点,每只三或四只小鼠,感染组每剂量都按照条件定量。对于个别小鼠,研究人员可以酌情决定是否将小鼠数据排除在外,包括不吸入全部剂量,鼻腔冒泡或通过口部感染引起的感染。


感染后,在任何动物实验中均未使用致盲法,且动物未随机分组。对小鼠进行接种疫苗,通过足垫注射为年轻和老年小鼠接种 20μl 的含明矾或模拟 PBS 的 0.2μg 双灭活 SARS-CoV 疫苗;然后在 22 天后以相同的方案加强小鼠免疫体质。对于所有组,按照实验方案,在实验过程中每天监测动物的疾病临床体征(驼背,毛皮松动和活动减少)。在头 7 天里,每天监测体重是否减轻,此后继续进行体重监测,直到动物恢复至初始初始体重或连续 3 天显示体重增加为止。所有体重下降超过其初始体重 20% 的小鼠都被喂食并每天监测多次,只要它们处于 20% 的临界值以下即可。


按照实验方案,立即处死体重超过其初始体重 30% 的小鼠。根据研究人员的说法,任何被认为垂死,或不太可能恢复的小鼠,将使用异氟烷过量进行安乐死,并通过颈脱位确认死亡,这种处理方式使用 UNC 机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案。


组织学分析


在实验结束后,取出左肺,浸没在 10% 福尔马林缓冲液(Fisher)中,不充气 1 周。将组织包埋在石蜡中,并由 UNC Lineberger 综合癌症中心组织病理学核心设施制备 5μm 切片。为了确定抗原染色的程度,使用市售的多克隆 SARS-CoV 抗核衣壳抗体(Imgenex)对切片进行病毒抗原染色,并以盲法方式对气道和实质进行染色,使用带有 Olympus DP71 相机的 Olympus BX41 显微镜捕获图像。


病毒中和测定和统计分析


在这一部分当中,噬斑减少中和效价测定法与先前表征针对 SARS-CoV 的抗体进行。简而言之,就是中和抗体或血清,并将其进行两次连续稀释,与 100pfu 不同感染性克隆 SARS-CoV 菌株在 37°C 温度下孵育 1 小时。然后将病毒和抗体以 5×10 5 孔 Vero E6 细胞添加到另一孔板中,并重复多次(n≥2)。


在 37°C 下孵育 1 小时后,研究人员需要在培养基中铺上 3 ml 0.8% 琼脂糖。在将板在 37℃ 下孵育 2 天,用中性红染色 3 小时并计数噬菌斑。计算噬菌斑减少的百分比为(1-((带有抗体的噬菌斑数量/没有抗体的噬菌斑数量))×100。


实验结束后进行统计分析,所有实验均与两个实验组(两种病毒,或已接种和未接种的队列)进行对比。因此,病毒的显著差异是通过在各个时间点进行检验确定的。最终的数据以正态分布,在每个比较的组别中,放置出相似的方差。(本文首发钛媒体App)

 


Nature论文地址:


https://www.nature.com/articles/nm.3985#auth-14


参考来源:


https://microbiology.utmb.edu/faculty/vineet-d-menachery-phd

https://www.the-scientist.com/news-opinion/lab-made-coronavirus-triggers-debate-34502

https://www.nature.com/articles/d41586-020-00262-7


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